德泰生物拥有超十年的蛋白表达经验,已成功交付5000+组蛋白,包括毒性蛋白、生长因子、酶等。主要应用于:作为抗原制备抗体;参与细胞实验与动物实验;测定蛋白酶活;研究蛋白相互作用(免疫共沉淀,GST pull down);蛋白结晶结构研究,免疫组化实验等,不同的应用对于蛋白的要求也互不相同。在进行蛋白表达时,通常要考虑以下几点:
服务内容 | 服务内容 | 德泰交付 | 价格 |
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原核蛋白表达 | 蛋白表达 |
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询价 |
内毒素去除服务 (可选) |
包括制备过程中内毒素控制及纯化过程中内毒素去除两部分,内毒素水平控制在0.01~1.0 EU/ug |
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大规模发酵服务 (可选) |
利用发酵工艺,提供毫克至克级重组蛋白制备,满足大量制备的需求 |
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实验流程 | 服务特色 | 周期 |
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密码子优化 | 自主研发MaxCodonTM生物信息学软件,对稀有密码子、密码子偏好性等因素进行分析优化(什么是密码子优化?) | ~2周 |
基因合成&载体构建 | 德泰拥有几十种表达载体:pET系列(pET28a、pET30a、pET43.1 a等),pGEX4T-1、pBAD24、pGADT7、pQE-30等 | |
表达小试 | 根据蛋白的性质选择合适的菌株:BL21 (DE3) 、OrigamiB(DE3)、Rosetta(DE3)、BL21 CodonPlus(DE3)、codon Plus(DE3)、ESL等 多种表达条件优化,增加可溶性蛋白表达量 |
1周 |
放大表达&蛋白纯化 | 放大表达&纯化,交付您需要的蛋白量 四大蛋白纯化方法,先进的AKTA纯化设备,可纯化标签/无标签蛋白 |
2~3周 |
蛋白质检 | SDS-PAGE、WB检测、质谱检测(可选) |
案例为蛋白酶A的制备,该蛋白的制备难点在于:
a. 该蛋白酶自身含有酶切位点,表达很难获得目的蛋白,在前段加入一段非信号肽的前肽,可以抑制蛋白酶A的活性,再通过快速纯化获得;
b. 在纯化过程中需要对该段前肽进行切除,需要低温快速纯化,难度较大;
c. 切除后的蛋白不含有标签,不能用标签亲和纯化,需要利用磁珠对目的蛋白进行纯化。
蛋白表达:目的蛋白很难直接表达出来,通过在蛋白序列前段加入一段非信号肽的前肽,使目的蛋白成功表达;
蛋白纯化:采用胰凝乳蛋白酶对加入的前肽进行切除。实验人员对酶切条件进行了多次摸索,包括酶切的时间、胰凝乳蛋白酶浓度、是否需要加抑制剂、抑制剂浓度及抑制时间等(全程共用凝胶34块)。最终找到了合适的酶切条件成功将前肽切除掉。自制磁珠亲和纯化柱,验证可用后利用磁珠亲和纯化柱纯化得到目的蛋白。
Lane M:SDS-PAGE Protein marker
Lane 1:酶切前
Lane 2:酶切后不加抑制剂
Lane 3:酶切后+抑制剂(TPCK)
Lane 4:与NHS磁珠孵育后FT
Lane 5-6:洗杂
Lane 7-10:洗脱目标蛋白
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