原核蛋白表达服务

德泰生物拥有超十年的蛋白表达经验,已成功交付5000+组蛋白,包括毒性蛋白、生长因子、酶等。主要应用于:作为抗原制备抗体;参与细胞实验与动物实验;测定蛋白酶活;研究蛋白相互作用(免疫共沉淀,GST pull down);蛋白结晶结构研究,免疫组化实验等,不同的应用对于蛋白的要求也互不相同。在进行蛋白表达时,通常要考虑以下几点:

  • 蛋白本身特性:蛋白的分子量大小,蛋白来源/物种,是否为毒性蛋白,蛋白翻译后修饰程度,蛋白结构复杂程度,在细胞内外的定位等;
  • 蛋白表达系统选择:不同蛋白表达系统有不同的优势,如表达量高低,能否糖基化修饰等,结合蛋白应用并全面考虑,选择最合适的蛋白表达系统;
  • 蛋白需求量:不同下游应用需求量有所区别,制备抗体需2~8mg,常规功能学研究10~200ug,细胞实验或药物研究则需更多;
  • 蛋白纯化标签去留:蛋白纯化标签主要有His,GST,SUMO,MBP等。His标签只有0.84kd,利于纯化且对蛋白无影响,可以保留;其他属于大标签,可以提高蛋白可溶性,但需要切除,否则会影响蛋白结构功能。
服务内容 服务内容 德泰交付 价格
原核蛋白表达 蛋白表达
  • 表达载体
  • 3-5mg,>90%纯度蛋白
  • 质检报告
  • 项目流程报告
询价
内毒素去除服务
(可选)
包括制备过程中内毒素控制及纯化过程中内毒素去除两部分,内毒素水平控制在0.01~1.0 EU/ug
  • 内毒素质检报告
大规模发酵服务
(可选)
利用发酵工艺,提供毫克至克级重组蛋白制备,满足大量制备的需求
  • 最终交付客户需求的蛋白量(或菌泥)
  • 实验流程

    实验流程 服务特色 周期
    密码子优化 自主研发MaxCodonTM生物信息学软件,对稀有密码子、密码子偏好性等因素进行分析优化(什么是密码子优化? ~2周
    基因合成&载体构建 德泰拥有几十种表达载体:pET系列(pET28a、pET30a、pET43.1 a等),pGEX4T-1、pBAD24、pGADT7、pQE-30等
    表达小试 根据蛋白的性质选择合适的菌株:BL21 (DE3) 、OrigamiB(DE3)、Rosetta(DE3)、BL21 CodonPlus(DE3)、codon Plus(DE3)、ESL等
    多种表达条件优化,增加可溶性蛋白表达量
    1周
    放大表达&蛋白纯化 放大表达&纯化,交付您需要的蛋白量
    四大蛋白纯化方法,先进的AKTA纯化设备,可纯化标签/无标签蛋白
    2~3周
    蛋白质检 SDS-PAGE、WB检测、质谱检测(可选)

    原核表达案例

    案例为蛋白酶A的制备,该蛋白的制备难点在于:
    a. 该蛋白酶自身含有酶切位点,表达很难获得目的蛋白,在前段加入一段非信号肽的前肽,可以抑制蛋白酶A的活性,再通过快速纯化获得;
    b. 在纯化过程中需要对该段前肽进行切除,需要低温快速纯化,难度较大;
    c. 切除后的蛋白不含有标签,不能用标签亲和纯化,需要利用磁珠对目的蛋白进行纯化。

    制备流程

    蛋白表达:目的蛋白很难直接表达出来,通过在蛋白序列前段加入一段非信号肽的前肽,使目的蛋白成功表达;
    蛋白纯化:采用胰凝乳蛋白酶对加入的前肽进行切除。实验人员对酶切条件进行了多次摸索,包括酶切的时间、胰凝乳蛋白酶浓度、是否需要加抑制剂、抑制剂浓度及抑制时间等(全程共用凝胶34块)。最终找到了合适的酶切条件成功将前肽切除掉。自制磁珠亲和纯化柱,验证可用后利用磁珠亲和纯化柱纯化得到目的蛋白。

    蛋白酶A纯化电泳图

    Lane M:SDS-PAGE Protein marker
    Lane 1:酶切前
    Lane 2:酶切后不加抑制剂
    Lane 3:酶切后+抑制剂(TPCK)
    Lane 4:与NHS磁珠孵育后FT
    Lane 5-6:洗杂
    Lane 7-10:洗脱目标蛋白

    图1:纯化得到目的蛋白
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