兔抗体库的多样化机制——V（D）J重排、类基因转换、体细胞超突变

多样化的抗体库对有效的体液免疫是必不可少的。体细胞超突变和转换重组在脊椎动物物种中广泛应用，体细胞基因转换作为一种免疫机制，在很大程度上限于在肠道相关淋巴组织（GALT）中初级抗体成分多样化的物种，例如兔子。这些物种通过一种与小鼠和人类完全不同的策略产生初级抗体库。免疫球蛋白（Ig）重链和轻链位点V（D）J基因重排过程中，小鼠和人类的B细胞通过利用许多不同的V（D）和J基因片段产生高度多样化的抗体库。而兔B细胞在V（D）J基因重排过程中，优先利用V_H1基因，重排产生的V（D）J基因作为后续抗体库多样化的突变底物。重组的V（D）J基因通过体细胞基因转换和体细胞超突变引入突变，这一过程产生了大量不同特异性的抗体，可以用于预测和抵御大量潜在病原。

兔初级抗体库的发育过程

在兔的骨髓中，V（D）J基因重排产生初始抗体库，这一过程受B细胞优先使用V_H1限制。兔子出生后约2天，B细胞离开骨髓，迁移到肠道相关淋巴组织（GALT）,滤泡开始发育。GALT是幼兔B细胞增殖和V（D）J基因多样化的主要位点，最大的GALT就是阑尾。B细胞迁移似乎会持续约1-2周，此后会急剧下降。B细胞在阑尾滤泡顶端聚集，同时形成滤泡树突状细胞（FDC）网络。大约1周时，特定共生肠道微生物的定植密度和阑尾微环境的发育达到了足以启动B细胞增殖和初级抗体库多样化阶段。在滤泡基底区B细胞开始增殖，强健的B细胞增殖驱动快速的滤泡扩张，在此过程中B细胞广泛多样化其V（D）J基因。在断奶前后的发育期（3-4周龄时），母乳中提供的多样化抗体库开始减少时，初级抗体库的多样化开始，表达多种V（D）J基因的B细胞迁移到外周，在随后的3周内高度多样化的初级抗体库建立。

V（D）J基因重排

V（D）J基因重排是抗体库发育的关键，新生兔和成年兔B细胞中的大多数V（D）J基因后区都进行了有效的重排。V_H区域是由三个非相邻基因V_H、D和J_H的重排在体细胞上产生的。兔子是已知的少数几种在Ig重链基因重排过程中有限使用V_H、D_H和J_H基因片段组合连接的脊椎动物之一。V（D）J基因重排过程中小鼠和人可以利用很多V_H，但对于兔子来说，80-90%的V（D）J基因优先采用V_H基因片段V_H1。剩余10-20%的V（D）J基因重排是采用另外两个V_H基因片段V_Hx和V_Hy。兔子所有的V_H基因都属于一个V_H家族。尽管50-100种系V_H基因具有功能，但可利用的V_H基因数量有限，整个兔Ab基因库仅由4个V_H基因产生。由于内含子调节或相对较低的甲基化程度等未知原因，V_H1优先重排。在小鼠和人类中，V_H基因的优先利用主要发生在胎儿期和新生儿期，成年期不明显。兔子V_H1基因的优先利用发生在整个生命周期。

V（D）J基因多样化

B细胞体细胞超突变（可能是非模板化的）和类基因转换（模板化的）事件的结合打破V_H1基因优先使用的限制，实现了初级抗体（Ab）基因库多样性。虽然兔子V_H区内的体细胞基因转换和超突变发生在相似的时间和位置，但兔子的抗体多样性大部分是由重组V（D）J基因的体细胞基因转换产生的。体细胞基因转换是将上游V_H基因段供体的核苷酸序列转移到重排的V_H基因段，通过CDR1和CDR2的不同组合产生组合位点多样性，这种机制随机性小，引入有害变化的概率低。另一种体细胞超突变可以将点突变引入到整个V（D）J基因，对高频率点突变进行靶向积累。值得注意的是，D区在重排的V（D）J基因中没有体细胞基因转换的上游供体基因，所以D区点突变只能通过体细胞超突变引入。

对于亲和力成熟来说，体细胞基因转换与超突变大有不同。通过体细胞基因转化可以快速产生多种B细胞受体。在Ag特异性免疫反应的背景下，体细胞基因转换（尤其是在CDR内）可能会改变Ag受体的特异性，而非亲和力。B淋巴细胞在成年兔中的生成是有限的，因此不会持续产生新的特异性Ag受体。体细胞基因转换与Ag诱导的外周受体编辑相似，可增加Ab库的整体多样性，挽救注定死亡的细胞。

兔与其他物种抗体多样化机制的差异

产生和维持抗体多样性的机制因物种而异。在兔的T细胞依赖性免疫反应中，除了利用体细胞超突变使其IgH基因多样化外，还使用了类似体细胞基因转换的机制。小鼠和人的Ab多样性主要依靠V（D）J基因重排，Ig基因在生发中心通过体细胞超突变实现多样化，很少发现体细胞基因转换。绵羊胎儿和新生儿发育过程中的Ab基因多样性依赖于体细胞超突变而非基因转换。鸡的V_H、V_L基因片段多样化的主要机制是基因转换。

在通过体细胞多样化建立初级Ab库的物种中，如鸡、羊和牛等，组合重排对多样化的贡献很小，且它们的多样化发生独立于外源性因素，开始于出生前，受发育调节。兔初级Ab的体细胞多样化依赖于来自肠道的外源性因素（如肠道微生物），开始于出生后1-2个月，不受发育调控，且GALT和肠道菌群之间的相互作用是Ab基因多样性所必需的。GALT的充分发育需要特定种类的常规兔肠道菌群，更需要Ab菌群的多样化。肠道微生物可能是通过B细胞超抗原直接刺激滤泡B细胞增殖和V（D）J基因多样化，也可能是通过识别微生物高度保守的分子模式的toll样受体，触发激活途径，刺激广泛的B细胞增殖和V（D）J基因多样化。

参考文献
[1]Shi-Kang Zhai, Dennis K. Lanning.Diversification of the primary antibody repertoire begins during early follicle development in the rabbit appendix[J].Molecular Immunology, 2013,54:140-147.
[2]Lanning DK, Knight KL. Diversification of the primary antibody repertoire by AID-mediated gene conversion[J]. Results Probl Cell Differ, 2015,57: 279-293.
[3]Dennis Lanning, Periannan Sethupathi, Ki-Jong Rhee, et al. Intestinal microflora and diversification of the rabbit antibody repertoire[J].J Immunol, 2000,165 （4）: 2012-2019.
[4]Candace R. Winstead, Shi-Kang Zhai, Periannan Sethupathi, et al. Antigen-induced somatic diversification of rabbit IgH genes: gene conversion and point mutation[J].J Immunol, 1999, 162（11）: 6602–6612.
[5]Tunyaplin C, Knight KL. Fetal V（D）J gene repertoire in rabbit: evidence for preferential rearrangement of V_H1[J]. Eur J Immunol, 1995, 25（9）:2583-2587.

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