单B细胞抗体开发技术

单克隆抗体（mAb）是制药市场上最重要的生物药物类型之一。目前，已有100多种单克隆抗体被批准用于治疗癌症、传染病、自身免疫性疾病和神经系统疾病等多种疾病。在当今快节奏和竞争激烈的药物开发市场中，加速开发单克隆抗体试剂是成功推进治疗性抗体的基本要求。

继经典的杂交瘤技术之后，已经开发和改进了许多其他方法，包括B细胞永生化技术、各类展示技术以改善单克隆抗体发现的途径。单B细胞抗体开发技术是近年来发展起来的新型单克隆抗体制备技术，该方法依赖于磁珠、流式、微流控等各类单细胞分离鉴定技术，结合PCR技术、DNA测序技术和抗体重组表达技术，实现从单个B淋巴细胞中分离表达天然配对的特异性抗体。单B细胞抗体开发技术实现了抗体的高通量筛选，克服了展示技术制备抗体的缺点，保留重链和轻链原始配对，能够筛选出高亲和力、特异异性的抗体。

该技术主要包括以下几个步骤：单个B细胞的分选、扩增和克隆抗体基因、抗体表达和鉴定。

单个B细胞的分选

B细胞亚群的选择

抗原特异性B细胞是获得抗原特异性单抗序列的主要来源，B细胞亚群的选择随技术路线的差异而不同。B细胞的发育是一个有序的过程，大致可分为祖B细胞（pro-B cells）、前B细胞（pre-B cells）、未成熟B细胞（immature B cells）、过渡B细胞(transitional B cells)和成熟B细胞(mature B cells)五个阶段。成熟B细胞到达外周免疫器官的B细胞区定居后，在那里接受外来抗原的刺激而活化、增殖进一步分化熟为浆细胞和记忆B细胞。

B细胞发育过程

浆细胞（plasma cell）是分泌抗体的终末分化细胞，具有非常低水平的膜免疫球蛋白表达，但表达MHC Ⅱ类分子（在分化过程中可通过负反馈途径抑制Tfh活化）。成熟B细胞除分化成浆细胞外，还有部分分化为记忆B细胞（memory B cell）。记忆B细胞表达膜免疫球蛋白但不分泌抗体。一般来说，记忆B细胞和浆细胞均在生发中心经过体细胞高频突变和亲和力成熟，其抗原亲和力较其他前体B细胞更佳，是单B细胞抗体开发常选择的B细胞亚群。

单个B细胞的分选方法

单个B细胞分选可分随机分离和抗原特异性分离，前者只需分离单个B细胞，操作较为简单，后者需分离抗原特异性B细胞，操作较复杂，尤其适合抗肿瘤抗体、自身免疫抗体等特异性抗体含量较低的情况。

随机B细胞分离的方法主要有显微操作法、激光捕获显微切法、流式细胞分选法等。抗原特异性B细胞分离的方法包括：磁珠分选法、荧光标记多参数流式细胞分选法、微流控分选法、微雕法以及细胞微阵列芯片法等。

磁珠分选法基本原理是基于B细胞表面标志物能与连接有磁珠的目标抗原相结合，在外加磁场中，通过与目标抗原结合的细胞被吸附而使细胞得以分离。这种方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出高纯度的细胞，在流式分选单细胞前可用磁珠分选法进行预分离，但是由于磁珠影响细胞生物活性因而不利于分离后培养与操作。

荧光标记多参数流式细胞分选法与流式细胞分选法类似，二者差异在于前者在加入用于标记B细胞表面标志物的荧光抗体之外还需加入荧光标记的目标抗原用来结合B细胞表面BCR以分选目标抗原特异性B细胞。该技术优点是可快速、准确、高通量分离B细胞并进行多参数同时分析。

微流控分选技术基于一个全封闭的检测系统。该技术可以将单个抗体分泌细胞与包被抗原的微球及捕获抗体的荧光标记二抗共同包裹在一个微液滴中。每一个微液滴相当于一个独立的微型反应器，抗体分泌细胞在液滴中培养一段时间后，通过荧光激活液滴分选系统可分选出含有目标细胞的液滴。

B细胞通常难以维持较长时间的离体存活，这对鉴定表达抗原特异性抗体的B细胞提出了挑战。可通过EBV转化、慢病毒介导的遗传修饰以及CD40L联合多种细胞因子的体外诱导培养等B细胞永生化技术延长细胞离体存活时间。

扩增和克隆抗体基因

细胞分选时，通常需将单个B细胞分至内含适量细胞裂解液、RNA酶抑制剂和PCR反应试剂的适当容器中，如96孔板。由于单个细胞内RNA含量少，适当的容器可以方便大批量操作、防止样品损失或交叉污染。另外，不同类型B细胞抗体分泌能力差异明显，如抗体分泌B细胞中抗体基因转录本含量远高于记忆B细胞，因此从抗体分泌B细胞中更容易扩增得到抗体基因。

通常从单个B细胞中扩增未知抗体基因，需使用合适的引物进行巢式或半巢式逆转录PCR（Nested or semi-nested RT-PCR），该过程要求引物具有通用性、灵敏性、特异性，能避免非特异性扩增又能扩增出完整的抗体基因序列，因此合理设计引物序列至关重要。通常针对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区。根据实验目的，如果分离和扩增不同同种型的抗体，反向引物则是特异性互补于各种同种型抗体恒定区的混合物。扩增出的抗体基因片段连接成scFv、scAb、Fab等形式，酶切将其构建到原核或者真核表达载体中。

抗体表达和鉴定

鉴定抗体的抗原特异性和生物活性前需将携带有抗体基因的表达载体在相应系统中表达，常用的是真核表达系统尤其是哺乳动物细胞表达系统，更有利于抗体的加工修饰，其产物的生物活性可靠性更高。常用的有HEK293和CHO等细胞系。根据目的抗体及实验目的不同，所选取的鉴定及筛选方法也各不相同。可通过SDS-PAGE、Western blotting、ELISA等常规方法筛选和鉴定抗体，也可通过流式检测、免疫沉淀、体内药物活性测定等方法进一步测定抗体与抗原的特异性、亲和力以及中和活性等生物学特性。