摘要:本文主要讲解了凝胶过滤色谱法(分子筛)在蛋白纯化实验中的应用,包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。
凝胶过滤色谱蛋白纯化法,又称为空间排阻色谱,分子筛等。其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。当样品从色谱柱的顶端向下运动时,大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱;而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中,且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同,分子量越大,流出时间就越早,最终分离分子大小不同的蛋白质。
通常,多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的,交联程度决定凝胶颗粒的孔径。常用的色谱基质有:葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)、聚丙烯酰氨凝胶(Bio-Gel P)等。高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子,或是除去低分子量缓冲液成分和盐,而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。
常用凝胶过滤色谱介质的分离范围 | |||
---|---|---|---|
凝胶介质 | 蛋白质的分离范围/103 | 凝胶介质 | 蛋白质的分离范围/103 |
Sephadex G25 Sephadex G50 Sephadex G100 Sephadex G200 Sepharose 6B Sepharose 4B |
1~5 1.5~30 4~150 5~600 10~4000 60~20000 |
Sepharose 2B Bio-Gel P-4 Bio-Gel P-10 Bio-Gel P-60 Bio-Gel P-150 Bio-Gel P-300 |
70~40000 0.5~4 5~17 30~70 50~150 100~400 |
AKTA凝胶过滤色谱分离蛋白质
色谱介质:Sephacryl S-200,蛋白质分离范围(5~250)×103
色谱柱:XK16/60预装柱
色谱设备:AKTA Explorer
混合样品:含单克隆抗体,分子量180000;牛血清白蛋白(68000),溶菌酶(14000)
NaOH 0.5 mol/L
NaCl 200 mmol/L
PB 20 mmol/L
PH7.0 缓冲液
纯化结束后,用0.5mol/L NaOH反向冲洗2柱体积,冲洗时间30~60min,冲洗结束后,用超纯水正向冲洗5柱体积,再用20%乙醇冲洗3柱体积,然后拆下柱子,两端封死,低温保存。
在色谱分离前,对样品进行离心和过滤,离心能除去大部分块状物,如果离心后样品仍不清澈,可用滤膜过滤。由醋酸纤维薄膜或PVDF材料制成的滤膜能够非特异性的结合少量蛋白。
严格控制上样体积,上样体积不超过柱体积30%。
若样品溶液体积较多,可以分多次上样,注意每次上样时间间隔,可根据电导色谱峰确定下一次上样时间。
1)提高装柱质量,使色谱柱装填匀实;
2)提高柱床高度;
3)控制上样体积,最大上样体积不超过柱床体积5%;
4)控制样品黏度与洗脱溶液黏度保持一致;
5)根据样品特点选择合适的洗脱溶液,调节洗脱溶液的离子强度或亲水性;
6)选择合适的凝胶柱(如何选择请参照上文)
1)提高装柱质量,装柱匀实——若柱装的太松,容易引起拖尾,装的太紧,会引起前沿;
2)柱较脏,再生色谱柱
1)柱床松动,重新装柱或反向冲洗柱
2)柱筛板堵塞,超声清洗筛板
3)柱干裂,重新装柱
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