细胞生长曲线绘制-细胞计数法

摘要：细胞生长曲线的绘制方法多种，本文主要介绍通过细胞计数法绘制生长曲线，帮助我们更好的了解细胞的生长状态及活力，从而指导下游实验操作。

细胞计数法绘制生长曲线，是细胞培养研究中常用的技术手段。原理就是通过测定单位体积内的细胞数量，得到细胞的总浓度进而计算出细胞总数。

典型的细胞生长曲线分为四个时期：延滞期，指数期，稳定期和衰亡期。不同时期的细胞生长状态和性能各不相同。通过测定生长曲线，可以测定细胞绝对生长数，判断细胞活力，可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响，有助于我们选择该时期的细胞进行细胞下游实验（瞬时转染或稳定转染）。以下介绍细胞计数的主要方法和注意点：

实验准备

1. 仪器：二氧化碳培养箱，显微镜，超净工作台，血球计数板
2. 试剂：胰蛋白酶，培养基（血清）

实验操作

1. 取生长良好的细胞，用胰蛋白酶消化，离心
2. 离心后去上清，加入新鲜适量的培养基重悬细胞，使之成为单细胞悬液
3. 按照一定的倍数稀释该单细胞悬液，稀释倍数以稀释结果细胞数在20-200之间为合适倍数
4. 准备血球计数板，洗净晾干
5. 吸取一定量的细胞悬液，加样到血球计数板上，显微镜下计数
6. 按照血球计数板的计数原理进行细胞计数
7. 计算细胞总数， 调整细胞至一定浓度（1×10⁵/ml）。细胞浓度=细胞计数板得到的细胞数量/4x稀释倍数x10⁴/ml
8. 细胞再培养，准备24孔板，每孔中加入0.1ml的细胞（即1×10⁴个细胞）和0.9ml的细胞培养基，轻轻晃动孔板（十字方向晃动），使细胞分布均匀，并进行常规细胞培养（48h后换液培养）
9. 培养48h后，即可每过24h取样一次，每次取样至少取3个孔的细胞，多次计数取平均值，提高准确性），取样细胞常规胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，显微镜下进行细胞计数
10. 计数结果，以时间（d）为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线

结果分析

根据培养的时间和细胞计数的结果得到如下图，细胞培养初始几天生长缓慢，为延滞期。两到三天之后细胞进入对数生长期，此时细胞生长最为旺盛，细胞活力也相对最佳，通常在我们的细胞转染或构建稳定细胞系时选择对数生长期的细胞。一段时间后细胞进入稳定生长时期

操作要点

• 细胞用胰蛋白酶消化，消化时间要自己把握，时间短细胞消化不好形成团状，时间长细胞死亡率可能会增加，制备成单细胞悬液即可
• 细胞计数时，按照计数原理数细胞，每个大方格中的细胞大于200小于20，则稀释倍数不适，需重新稀释。在消化细胞计数之前，可自己估算培养瓶中的总细胞数，这样可以预估下稀释的倍数，避免重新稀释
• 细胞接种时细胞摇均匀，接种按照十字方向晃动，晃动时间可以延长，以避免形成细胞团为准，但要防止细胞液溅出
• 细胞培养易被污染，污染原因也多种多样，实验室环境，细胞自身原因，如果为菌类污染建议丢弃重新复苏培养，更多相关情况及解决可参考资料专区细胞培养FAQ

细胞计数法绘制生长曲线，操作相对简便。此外，MTT比色实验也能检测细胞的存活和生长，得到细胞生长曲线，且灵敏度高，重复性好，具体原理和操作见MTT法绘制生长曲线。