基因合成的原理与应用

摘要：基因合成是体外合成双链DNA的一种方法，是获取目的基因的手段之一，本文主要介绍了不同获取目的基因的方法及基因合成的原理、应用与优势。

人工合成基因出现在上世纪60年代，通过基因合成，可以获得自然界中不存在的基因。目前，获取目的基因的方法主要有三种：逆转录，PCR扩增，人工合成 。逆转录法主要适用于获得分子量较大的未知序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，设计上下游引物，借助逆转录酶合成碱基互补的DNA链（即cDNA），在DNA聚合酶的作用下合成cDNA，即目的基因的双链DNA。PCR主要适用于已知序列的扩增，获得大量的目的片段，供人们肉眼观察（RT-PCR可实现对起始模板的定量分析）。人工合成法就是采用化学合成的方法获取目的片段，化学合成准确率较高，速度较快，同时根据不同的下游应用和密码子的偏爱性，设计基因序列，提高表达水平。

原理

DNA合成的方法主要采用固相亚磷酰胺三酯法，运用此方法的DNA合成仪有很多，常用的有ABI 394合成仪、ABI39OO高通量合成仪，它们的区别主要在合成效率，试剂用量，耗时等方面，合成的原理是相同的，合成原理如图：

Step 1：DMTro是5’羟基的保护基团，用TCA（三氯乙酸）和预先连接在固相载体（CPG）上的核苷酸的5’端发生反应，脱去DMT，使5’羟基端游离

Step 2：亚磷酰胺保护的dNTP和活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，此时3’端被活化，5’-羟基被DMTro保护

Setp 3：1、2步的产物发生缩合反应偶联，形成新键C-亚磷酯键

Setp 4：1中会剩下部分未参与反应的5’-羟基，通过乙酰化的方法封闭5’-羟基

Setp 5：3步形成的C-亚磷酯键不稳定，易被水解，所以用氧化剂碘将其氧化成更稳定的磷酸三酯键

通过以上步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体上，将其5’端的DMTro切除，重复以上步骤合成所有需要的碱基，最后经过氨水高温处理，将合成的链从固相载体CPG上切下来，根据不同的下游应用纯化处理后保存。

PCR扩增简单方便，但不能保证基因序列的完全正确性，扩增存在突变风险，且PCR对模板也具有一定的要求，因此适用性存在局限性，相对于此基因合成具有如下优势：

优势

1. 可以保证基因序列的完全正确性，无突变
2. 合成周期短
3. 不受模板来源限制
4. 根据不同应用，设计优化基因序列，提高表达水平

应用

人工基因合成具有极大的灵活性，根据需求自行改变设计序列

1. 进行基因优化，提高基因表达
2. 合成已知序列的难扩增基因
3. 合成大量用于微芯片的cDNA
4. 克隆人鼠抗体或重组抗体
5. 设计合成基因疫苗、基因治疗载体
6. 根据基因的结构功能研究，修改设计基因
7. 合成不同的基因突变株、SNPS、或其它突变株