杂交瘤细胞克隆化的常用方法

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆,在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的方法很多，有有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。这里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法:

有限稀释法

材料

96孔细胞培养板、HT培养基、活力强的杂交瘤细胞、小鼠腹腔细胞

方法

1. 制备小鼠腹腔巨噬细胞（饲养细胞）；
2. 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15、50个细胞3种不同的稀释度；
3. 按照每毫升加入5×10⁴-1×10⁵细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞；
4. 进行杂交瘤细胞96孔板分装，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10；
5. 37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的阳性孔，再次进行克隆
6. 重复上述步骤3~5次，直至阳性孔率100%
7. 进行抗体检测、细胞胞扩大培养并冻存。

说明：本法中（b）（c）（d）等步骤也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确的进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞，按每孔接种0.1ml细胞悬液，即每孔含1个细胞。

软琼脂法

材料

HT培养基（双倍浓度）、小鼠腹腔细胞、灭菌平皿、活力很好的杂交瘤细胞、45℃水浴、2%琼脂糖生理盐水（用0.15mol/L NACl配置的2.0%琼脂糖，称取2.0g细胞培养用琼脂糖，悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌15分钟，分装10ml小瓶，冷却后4℃保存）

方法

1. 在培养皿中制备单层饲养细胞（小鼠腹腔细胞）；
2. 临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45%水浴中温育；
3. 制备杂交瘤细胞悬液：吸取平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10 min；
4. 取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于培养皿上层；
5. 37℃、7.5% CO₂湿润培养7-14天，克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养；
6. 吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。

注意事项

• 杂交瘤细胞的克隆化需尽早进行，避免其他细胞影响了抗体分泌细胞的生长。
• 注意无菌操作，一旦发现污染必须及时处理。
• 做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清。
• 每次克隆化得到的阳性亚克隆，在继续进行克隆化或扩大培养的同时，应及时冻存几支。

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