单克隆抗体的规模生产

基于杂交瘤细胞的单克隆抗体规模生产主要分为体内方法和体外方法。体内方法通常指的是利用活体动物生产单克隆抗体，最常用的是小鼠腹水法。体外方法指的是在细胞培养瓶或生物反应器中进行杂交瘤细胞的培养，从而生产单克隆抗体。

体内生产（小鼠腹水法）

小鼠腹水法操作简单，通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，让细胞在腹腔内生长并产生腹水，从而获得大量的单克隆抗体。这种方法获得的抗体中常混有小鼠的各种杂蛋白，多数情况下需要纯化后才能使用，并且存在污染动物病毒的风险。

影响体内生产和优化的变量包括小鼠的年龄、性别、宿主品系、接种杂交瘤细胞数量、腹水采集次数以及引物的类型和体积，可以优化这些变量来调整腹水产量和单克隆抗体浓度。例如，产生少量腹水的亚克隆通常只在腹膜腔中形成几个大肿瘤，而产生大量腹水的亚克隆形成大量小肿瘤集落，在整个肠系膜中广泛生长。因此，应选择形成侵袭性较小的软肿瘤的克隆。从一组小鼠中顺序穿刺可以获得最高的单克隆抗体产量和最高的浓度。除了只允许一次腹水采集的侵袭性很强的细胞系外，顺序穿刺通常会将每克单克隆抗体所需的小鼠数量减少2~3倍。允许穿刺的次数应基于小鼠的临床状况，一般来说，最大值应为三次。

优化体内生产需要减少细胞系的侵袭性，以便所有小鼠在腹水产生后能继续存活。常用的两种方法包括选择合适的克隆或改变注射到小鼠腹膜腔中的杂交瘤细胞浓度。产生的单克隆抗体的体积和浓度取决于所选的克隆，因此获得最大体内产量的最佳方法是在小鼠中筛选并使用最佳产量的克隆。体内细胞生长条件是最佳的，几乎所有细胞系都会产生抗体，即使它们没有经过优化。这就是为什么注射到小鼠中通常会挽救难以在体外生长的细胞系。

小鼠腹水法的优势

小鼠腹水法制备单克隆抗体的成本相对较低；
通常会生产出高浓度的单克隆抗体，不需要进一步的浓缩，可以减少抗体变性或者有效性降低的可能；
当使用相当数量的单克隆抗体时，可以避免体外生产单克隆抗体导致的批间差异；
操作简单，无需进行细胞培养。

小鼠腹水法的不足

会引起小鼠的严重疼痛或痛苦；
需要对小鼠进行持续日常观察；
体内方法生产的单克隆抗体可能含有小鼠蛋白和其他污染物，需要进一步纯化或处理；
如果必须使用需要在SPF等级条件下饲养的免疫缺陷小鼠，可能会增加额外的费用。

体外生产

杂交瘤细胞属于半贴壁性质的细胞，既可以进行单层细胞培养，也可以进行悬浮培养。体外极小规模生产（小于10g）通常使用简单的低密度细胞培养系统，通过将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10~15%小牛血清的培养基培养，收集培养上清，上清中单克隆抗体含量约10~50 μg/mL。然而，这种方法生产的抗体量有限，大量生产需要进行杂交瘤细胞的高密度培养。对于小规模和中规模生产（10~200g），通常使用中空纤维系统、细胞悬浮培养瓶或滚瓶培养，进行大规模生产（超过100g），可以选择在搅拌式生物反应器、灌注式生物反应器、气升式生物反应器或连续培养系统中进行均质悬浮培养。

体外生产不使用活体动物，同时可以通过细胞驯化使用低血清或无血清培养基进行生产，减少了外来抗原（但使细胞系适应低血清或无血清培养基，通常对细胞系有轻微的抑制作用）。随着一次性材料成本的进一步降低和技术变革提高生产效率和降低设备成本，体外生产的成本应进一步降低。

体外方法失败的最常见原因之一是难以保证细胞培养过程中操作的一致性，例如培养器皿、设备、培养基的灭菌以及系统中的湿度和温度控制。在中大规模中，必须进行严格的程序和环境控制，以最大限度地减少系统微生物污染造成的损失，这些可能是增加体外单克隆抗体生产成本的原因。

体外方法的优势

体外方法减少了抗体生产阶段小鼠的使用；
体外方法通常是大规模生产的首选方法；
体外方法避免了向IACUC提交动物方案的需要；
体外方法避免或减少了对在动物实验方面经验丰富的实验室人员的需求；
基于半透膜系统生产的单克隆抗体浓度通常可达到腹水中的抗体浓度，并且不含小鼠腹水污染物。

体外方法的不足

小部分杂交瘤（3~5%）在培养基中生长不佳，甚至可能在培养过程中丢失；
与通过腹水法获得的单克隆抗体相比，体外生产的抗体亲和力可能较差；
与体内生产相比，抗体适当糖基化的损失可能使抗体产品不适合体内实验，这可能导致抗体产品的免疫原性增加、结合亲和力降低、生物学功能改变或体内清除加速；
体外方法通常需要使用FBS，这限制了某些抗体的应用；
对于小规模或中规模的单克隆抗体生产，体外培养方法通常比腹水方法价格更高；
与小鼠腹水法相比，体外培养上清液单克隆抗体的浓度较低；
体外方法生产的单克隆抗体数量受实际可用设备数量的限制。

单克隆抗体生产方式的选择

单克隆抗体生产三大商业用途分别为诊断、治疗以及新型治疗药物研究和开发，所需的单克隆抗体量以及成本、时间和合规性等因素的考虑取决于目的。商业利益认为0.1~10g的抗体生产规模为小规模，10~100g为中等规模，超过100g为大规模。竞争非常激烈的诊断行业关注成本、周转时间和监管要求，规模通常为中小型，很少达到大型规模。与诊断行业相比，治疗行业对成本和周转时间的关注要少得多，其生产规模为中大型。由于受到高度监管，对任何程序变更都非常敏感。开发治疗药物的biotech单克隆抗体生产规模为中小型，他们比治疗行业更关心生产成本，但关心程度不及诊断行业，同时更关注周转时间，这是因为产品的生命周期较短，需要获得率先进入市场的机会。

商业单克隆抗体生产需要的不仅仅是大批量细胞的培养或将其注射到大量小鼠中，还需要大量的生产前工作，以确保细胞系稳定，能够生产出适当数量的稳定抗体。还涉及搭建用于体内和体外生产以及抗体加工的高质量设备平台，设立质量控制和质量保证部门来满足商业产品所需的良好生产规范的要求。产品批次测试对于确保产品可重复性是必要的。生产过程验证和记录对于保护消费者同样如此。FDA在其法规《人用单克隆抗体产品制造和测试中的考虑要点》（FDA1997）中要求进行生产过程验证和记录。

考虑到商业可行性，体内生产通常更具有经济性。然而，随着单克隆抗体量的增加，现有的体外生产技术可能更加经济，因为与体外生产相关的一些较高固定优化成本（选择具有最佳生长和生产特性的亚克隆以及在低血清或无血清条件下生长相关的成本）被分摊到更大的生产量上，使每克成本与体内生产相比具有竞争力。在大规模生产运行中，如果可以使用无血清培养基，它们可以减少动物使用并减少污染性外来抗原的存在。当单克隆抗体生产的时间很关键且需要量少时，选择体内生产，因为它只需要6周。对于体外系统，时间需求则差异很大。商业数量的单克隆抗体体外生产比体内生产需要更多的时间，因为工艺优化过程漫长且生产给定量的单克隆抗体时间增加。

在治疗行业，确定单克隆抗体是否具有预期效果的早期研发工作通常使用体内来源的单克隆抗体进行，因为周转时间更短且生产成本更低。公司会同期开发体外生产工艺。产品开发和体外优化完成后，公司会生成最终产品有效性信息，并向FDA提交最终的工艺验证文件。治疗行业体外生产主要使用无血清体外技术，以避免反复接触外来抗原引起治疗相关的过敏反应。

而在诊断行业，激烈的竞争导致压倒一切的成本考虑，而外来抗原的存在则不那么重要。因此，通常使用体内来源的生产方式。体内程序经过优化，通过减少杂交瘤侵袭性和增加单克隆抗体分泌来提高生产率。这种优化可以将动物用量减少2~10倍，从而大大降低生产成本。

研究行业最关心单克隆抗体的生产周期和结合亲和力。使用体内方法还是体外方法取决于项目的目的以及该系统中细胞系产生的单克隆抗体的量。对于极小规模的生产，通常使用腹水生产，因为它比体外生产宽容得多，并且无需优化体外培养中的细胞系即可完成。

参考文献
[1]SUN Jing-jing, ZHOU Wei-wei, ZHOU Lei-ming, et al. Advance in Large-Scale Culture of Hybridoma Cells in Vitro[J]. China Biotechnology, 2018, 38(10): 82-89
[2]National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies. Monoclonal Antibody Production. Washington (DC): National Academies Press (US); 1999. 5.