酵母蛋白表达步骤/实验流程

本文主要讲述了酵母蛋白表达步骤，详细酵母表达流程。从感受态细胞制备，转化方法选择及操作，从化学试剂PEG1000转化，电击转化，原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛选及最终的蛋白表达，全套酵母蛋白表达标准操作流程。

质粒线性化

在酵母表达系统中已经介绍了酵母蛋白表达原理，因此线性化是酵母转化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

转化方法

转化方法	转化效率	是否会多拷贝整合	操作
原生质体法	105	是	操作复杂
电穿孔法（电击）	105	是	操作方便
PEG诱导转化	105	否	操作方便

毕赤酵母PEG1000转化及感受态制备

• 配置缓冲液

1）缓冲液A：1.0M 山梨醇，10mM甘氨酸，pH8.35,3%（v/v）乙二醇，滤膜过滤，-20℃保存；

2）缓冲液B：40%（w/v）PEG1000，0.2M 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；

3）缓冲液C：0.15M NaCl，10mM 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；

4）未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存

将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；样品的转化，进行多组试验。

• 感受态制备

1）接种酵母受体菌单菌落于YPD平板（YPD：蛋白表达试剂配置），30℃培养2天；

2）挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；

3）过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mlYPD培养基中震荡培养至OD值从0.1至0.5~0.8；

4）3000~5000rpm离心收集沉淀菌体，用50ml预冷A液洗涤，并重悬与4mlA液中；

5）根据每次使用量（0.1-0.2ml左右）分装与1.5ml离心管中，每管加入10ul的预冷DMSO，混合后迅速-80℃/液氮（感受态可以放到-80℃ ，但是酵母表达建议感受态现做现用）

• 酵母转化

1）线性化质粒50ug（可预冷）溶于200ul的TE中，直接加入冻存的酵母感受态中；

2）37℃水浴5min，过程混合样品2次；

3）取出加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；

4）30℃水浴1小时；

5）室温2000rpm离心10min，去上清，得沉淀，重悬菌体与1.5ml缓冲液C中；

6）再次离心，去上清，得沉淀，轻轻加入0.2ml缓冲液C重悬；

7）将重悬的转化液涂与选择性培养基（根据抗性配置）中，30℃孵育3-4天，进行鉴定。

毕赤酵母电击感受态细胞制备及转化

• 感受态制备

1）接种酵母受体菌单菌落于YPD平板，30℃培养2天；

2）挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；

3）过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mlYPD培养基中震荡培养至OD值1.2~1.5；

4）4℃，5000rpm离心5min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体；

5）4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体；

6）再次4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体；

7）20ml，1mol/L山梨醇洗涤1次；

8）将菌体溶于200ul，1mol/L预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化

• 酵母电转

1）准备好80ul的酵母感受态与线性化的质粒1-5ug（冰上预冷15min）混合，迅速放入0.2cm的电击杯中（电击杯冰上预冷灭菌），电击；

2）电击结束，迅速加入1ml山梨醇，涂平板（在摇床上培养1h后涂平板也可）；

3）MD培养基生长3-4天，ROB培养基上生长4-5天后，鉴定。

• 电击注意点

1）线性化质粒的含量在1-5ug，纯度越高越好，量要有保证，很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成；

2）感受态菌液收集，确定OD值在1.2-1.5之间，可以稀释不同倍数，判断是否是线性关系，菌液浑浊单OD值不高，可能是OD稀释倍数不够；

3）感受态保存，感受态制备但其他还没处理好，冰上放置的时间对转化效率也会有影响，因此还是那个原则：现做现用；且分装成每次够用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；

4）电击杯清洗，先洗净吹干，浸泡在75%乙醇中，使用前超净台紫外灭菌，重复使用对实验也会有一定影响；

5）电击参数，电压及电击时间可以摸索，适当增加电压或延长电击时间，电击过程冰上操作

毕赤酵母原生质体法转化及感受态制备

• 原生质转化原理

酵母细胞具有细胞壁，细胞壁会组织其对外源DNA的摄入，因此，去除掉部分的细胞壁有利于酵母细胞对DNA的吸收。利用藤黄节杆菌酶（为一种葡聚糖酶），可以部分消化细胞壁。关键在于不能过度的消化细胞壁，否则将造成细胞死亡。藤黄节杆菌酶的消化能力受到SDS的影响，可以加入SDS对其消化进行控制，以得到消化适度的细胞。消化获得70%的原生质细胞时，效果最好。

• 试剂配制

转化当天，配制如下溶液：

① SE：1M山梨醇，25mM EDTA，pH8.0

② SCE：SE：1M山梨醇，1mM EDTA，10mM柠檬酸钠缓冲液，pH8.5

③ SOS：1M山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl₂

④ CaS：1M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl₂

⑤ DTT，PEG：DTT水配制为1M浓度，PEG用水配制40%（w/v）

⑥ CaT：20mM Tris pH7.5,20mM CaCl₂

⑦ 藤黄节杆菌酶：用水配制成3mg/ml的浓度

⑧ 5%SDS溶液，RD融化琼脂100ml，1M山梨醇

每次转化时配制

① SED：19mlLSE加1ml DTT

② PEG/Cat：1:1混合40%PEG及Cat

其他试剂

① YPD培养基1L，YPD平板1L

② RDB平板1L，RDHB平板1L

• 感受态制备及消化细胞壁

1）接种酵母受体菌单菌落于YPD平板，30℃培养2天；

2）挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；

3）取培养的细胞5ul，10ul，20ul分别加入到含有200mlLYPD的液体培养基中，30℃震荡过夜（300rpm）；

4）第二天测每个培养瓶中的OD600值，并取出事先配置好的转化溶液，室温放置：

5）收集OD600值在0.2-0.3对应的培养瓶中的细胞，室温离心（1500rpm5min左右），得到沉淀；如果没有培养瓶中的OD值在0.3左右的话，选择一个培养瓶，用新配置的培养基以1：4稀释，再次培养（2-3h左右），直至出现OD值为0.2-0.3，收集细胞；

6）准备去除细胞壁，准备去壁试剂和待去壁的细胞；

7）准备去壁试剂：现配SED，保证DTT（分析级）的新鲜度，配完放-20℃；

8）准备带去壁细胞：先用灭菌水清洗，转入离心管；1500rpm离心5min，收集细胞，用20mlSED重悬并洗涤离心；再次用1M山梨醇洗涤，离心（同上）；用SCE重悬，分开至两个离心管中（每管10ml左右）；

9）准备藤黄节杆菌酶，取一管酶放置冰上，以上准备的两管细胞取出一管加入藤黄节杆菌酶，开始消化细胞（这一步可确定酶消化的最佳时间）；

最佳时间的确定

① 准备20ml 5%SDS溶液分光光度计调至800nm，空白对照为800ul5%SDS及200ul SCE；

② 准备10个离心管，编号为0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50（根据时间编号）；

③ 取上述8步中的另一管细胞，取出200ul加入至0号管中，放置冰上，此为0点；

④ 加入7.5ul藤黄节杆菌酶在剩余的细胞中，轻混，30℃孵育（不要晃动）用来建立最佳时间所用

⑤ 2min时取200ul悬浮液至2号管中，同理4,5,6,7,8min时重复操作，读样品OD800值；

⑥ 用公式计算细胞去壁的效率：%去壁率=100-{（T时间OD800-0时间OD800值）x100}

10）计算出去壁率为70%左右时，得出最佳消化时间，同样操作加入7.5ul消化酶于另一管中消化细胞

11）室温离心去除悬浮液，1M山梨醇洗涤一次，0.6mlCaS悬浮细胞，立即转化，去壁的细胞应立即转化。

• 转化毕赤酵母

1）取100ul将去壁细胞，放入1.5ml离心管中（灭菌）；

2）准备10ug线性化质粒（预冷）与去壁细胞混合，加入1ml新鲜PEG/Cat溶液，轻混，室温孵育10min；

3）室温750rpm离心10min，去除PEG/Cat溶液；并用150ulSOS培养基悬浮转化细胞，室温孵育20min；

4）加入800ul 1M山梨醇，涂平板；

5）取200ul转化细胞和RD（液体）混匀倒于RDB平板上，凝固后导致平板，30℃培养4-6天，出现转化子；

6）取100ul稀释细胞，与RDH（液体）混匀，涂在RDHB上，凝固后倒置生长，30℃培养4-6天，出现克隆，表明去壁细胞可再次生长为分裂细胞。

阳性转化子的筛选与蛋白表达

• Mut⁺和Mut^s表型的判断

待转化子在平板上生长一段时间后，进行Mut⁺和Mut^s的筛选。挑取单克隆，在MM及MD培养基上划线或点（先在MM平板上点，再在MD平板上点，一个克隆换一次牙签），30℃培养2天。观察，在MD培养基上生长而在MM培养基上不生长或长的很小即为Mut^s表型，其余为Mut⁺表型。

• Mut⁺的诱导表达

1）挑取单菌落，摇菌，在25mlMGY或BMG或BMGY培养基中，30℃，300rpm培养至OD600为2-6（培养15-18h左右观察）；

2）室温2000rpm离心5min，收集菌体，用上述培养基重悬，使OD600为1.0左右；将菌液至于1L摇瓶中，30℃300rpm培养，每24小时加入100%甲醇，至终浓度为0.5-1.0%；

3）根据时间点取样（1ml）至于1.5ml离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；

4）可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。

• Mut^s的诱导表达

1）挑取单菌落，摇菌，在25mlMGY或BMG或BMGY培养基中，30℃，300rpm培养至OD600为2-6（培养15-18h左右观察）；

2）室温2000rpm离心5min，收集菌体，用上述培养基重悬，使OD600为1.0左右；将菌液至于1L摇瓶中，30℃300rpm培养，每24小时加入100%甲醇，至终浓度为0.5-1.0%；

3）根据时间点取样（1ml）至于1.5ml离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；

4）可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。

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