酵母表达原理

本文主要讲述了毕赤酵母蛋白表达的原理，毕赤酵母表达能够高效表达的机制。
巴斯德毕赤酵母（以下简称毕赤酵母）能够高效表达外源基因，是因为其有更强的强启动子，即醇氧化酶启动子PAOX。甲醇营养型酵母能将甲醇分解为甲醛和过氧化氢，在此反应中参与的酶是醇氧化酶（AOX1和AOX2）。其中，AOX2的表达量比AOX1低得多，以甲醇为唯一碳源时，AOX1增至细胞总蛋白的40%。PAOX1受甲醇诱导和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1的表达受到甲醇的严格控制。

巴斯德毕赤酵母所表达的外源基因位于酵母染色体上，这是通过把携带外源基因的表达质粒线性化，以同源重组的方式整合到强启动子PAOX1的下游，目的基因一般插入到5’AOX1启动子和转录终止子之间的单克隆位点。

毕赤酵母蛋白表达系统

1. 酵母表达宿主菌

• Mut⁺和Mut^s

在毕赤酵母表达系统中，乙醇氧化酶有两种基因编码，即AOX1和AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力有AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。当AOX1缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，这种细胞利用甲醇能力低，在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为Mut^s。存在AOX1，细胞利用甲醇正常生长，在甲醇培养基上生长较快，这种菌株表现型为Mut⁺，这就是甲醇营养型毕赤酵母表达两种Mut^s和Mut⁺产生的原理。

• 酵母表达系统常用宿主菌

GS115、KM71、SMD1168是常用的表达宿主菌，均为甲醇诱导型。他们都是组氨酸缺陷型，如果表达载体上带有组氨酸基因，可以补偿宿主菌的组氨酸缺陷，所以可以在不含组氨酸的培养基上筛选重组转化子。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的培养基上生长时，AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，宿主菌的AOX1基因被强烈诱导，使目的基因大量表达。

• 有无甲醇诱导产生的Mut⁺和Mut^s表现型

毕赤酵母的最适生长温度为28-30℃，诱导期间超过32℃，不利于蛋白表达，并可能导致细胞死亡。Mut^s和Mut⁺菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样，存在甲醇的情况下，AOX1启动子被强烈诱导，Mut⁺较Mut^s生长更快（4-5倍）。

2. 酵母蛋白表达载体

• 酵母蛋白表达载体的选择

酵母表达产物有胞内表达和分泌到胞外表达两种方式，这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽，可根据基因表达的定位及目的选择合适的酵母蛋白表达载体。

① 胞内表达载体：主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。该类载体将目的基因表达在胞内，可避免酵母的糖基化，适合于通常在胞浆表达或不含-S-S-的非糖基化蛋白，较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。

② 分泌到胞外表达的载体：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，将外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列由89个氨基酸组成α交配因子的引导。

③ 多拷贝插入表达载体：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下，重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

• 表达重组蛋白使其具体天然的N端

想实现表达重组蛋白使其具体天然的N端，将目的基因直接连接在Kex2蛋白酶切位点之后。Kex2蛋白酶切位点在信号肽序列中谷氨酸和精氨酸连接处：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala  *位置为Kex2蛋白酶的酶切位点

毕赤酵母表达系统机制/原理

毕赤酵母能够高效的表达外源基因，是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子（AOX1和AOX2）。AOX1和AOX2及其产生的Mut^s和Mut⁺表现型前文已经叙述过。AOX1受甲醇的诱导和葡糖糖或甘油的抑制。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上，通过把构建的质粒/载体线性化（主要采用酶切），通过同源重组的方式整合到启动子AOX的下游，一般是插入到5’AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。

毕赤酵母同源重组的方式，见酵母蛋白表达系统介绍。