相关技术:PCR标准操作流程
本文根据自身实验经验总结,针对PCR实验过程出现的问题举例,提供可实施的解决方法。并根据经验列举了提高PCR反应特异性的方法。
现象:正对照有条带,样品无条带
可能原因:
解决方法:
现象:空白对照出现条带
可能原因:
解决方法:
现象:电泳出现拖尾、涂抹带
可能原因:
解决方法:
一般小于100bp的条带可基本判断为引物二聚体
主要原因:
解决方法:
引物最好在模板cDNA的保守区设计,长度15-30bp,GC含量小于60%,3’端不超过连续三个G或C,碱基分布错落有致,避免引物自身形成二聚体,设计完成之后,需进行BLAST检测,如果与其他基因不具有互补性,则可以进行下一步实验。
降落PCR是一种简单的降低非特异性产物的PCR,最大的优点就是可以降低实验耗时,同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度,退火温度过高会使PCR效率过低,过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高PCR的特异性和效率。
采用热启动方法进行扩增,是除了设计最佳引物之外,提高PCR反应特异性最好的方式。在一般的PCR反应中,试剂的配置需在冰上进行,且要将PCR仪预热,这种方法就类似于热启动,能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性,只要体系中有DNA链存在,就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前完全抑制酶的活性,而最有效的方法就是使用热启动酶或高保真酶去扩增,它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心,当温度上升到95℃时恢复活性,指导扩增。
采用巢式PCR进行扩增,在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通PCR不同的是,它采用两对引物进行扩增,首先用第一对引物普通PCR,然后将第一轮扩增的产物稀释100倍后用第二对引物(巢式引物)二次扩增。因此采用巢式PCR可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。
琼脂糖凝胶浓度 | DNA分离范围 |
---|---|
0.3% | 5000-60000 |
0.5% | 1000-30000 |
0.7% | 800-12000 |
1.0% | 500-10000 |
1.2% | 400-7000 |
1.5% | 200-3000 |
2.0% | 50-2000 |
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