PCR标准操作流程

相关资料：PCR问题及提高PCR特异性方法总结

本文介绍了PCR的详细操作流程，强调了实验中的注意事项，列举了常用缓冲液的配方。帮助我们在理解实验的基础上更顺利的操作。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于与其目的片段两端互补的特异引物和高特异性的酶。典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。

一．试剂准备

1. DNA模板
2. 特异性引物
3. dNTP Mix
4. PCR buffer
5. 热启动酶

二．操作步骤

1.配置反应体系

将各成分依次加入到0.5ml的离心管中

试剂	终浓度
buffer	1x
dNTPs	<0.4mM
Forward primer	<0.4uM
Reverse primer	<0.4uM
Template DNA	<100ng
热启动酶	5U
ddH2O	Up to 50 ul

扩增使用热启动酶，可在常温下操作，非热启动型的酶要在低温配置反应体系。

2.按照试剂盒说明书设置反应时间和温度，扩增结束后电泳鉴定

3.琼脂糖核酸电泳

• 将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子
• 根据要分离的DNA片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入30ml左右的电泳缓冲液（TAE或TBE）
• 在微波炉中加热融化后冷却至40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中
• 室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样
• 在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡
• 样品点样前准备好，（在八连管中）加入5ul样品，1ul的6xLoding buffer和1ul的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔
• 按照正负极（红正黑负），接通电源，电压40-60V，时间30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳
• 电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小

不同的琼脂糖浓度分离不同大小的DNA片段：

琼脂糖的浓度/%	0.3	0.5	0.7	1.0	1.2	1.5	2.0
DNA大小/kb	5-60	1-30	0.8-12	0.5-10	0.4-7	0.2-3	0.05-2

三．注意事项

引物

引物是决定PCR反应成败的关键，要保证扩增的准确、高效，引物的设计要遵循如下原则：

1. 引物的设计在cDNA的保守区域，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析的软件，得到不同基因相同的序列就是该基因的保守区
2. 引物的长度：15-28bp，长度大于38bp，会使退火温度升高，不利于普通Taq酶的扩增
3. 引物GC含量在40%-60%，Tm值最好接近72℃
4. 因密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位（最好为T）
5. 碱基分布错落有致，3’端不超过3个连续G或C
6. 引物自身不要形成发夹结构，引物设计完成，要BLAST验证

模板

PCR扩增对模板的要求不高，单链、双链DNA均可作为扩增片段，虽然PCR能够扩增微量的DNA，为了保证扩增的特异性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：

模板	加入量
λDNA	100pg-100ng
质粒DNA	100pg-10ng
大肠杆菌基因组DNA	100pg-100ng
人类基因组DNA	10-200ng

模板可以是纯化后的样品也可以是粗制品，不同来源的模板采取不同的处理方法，实验模板的纯化越简单越好，但模板中如果含有任何的Taq酶抑制剂、蛋白酶、核酸酶等，会干扰反应。模板提取注意保存，不能放置太久，避免反复冻融并防止降解。多数人会忽略这一问题，当实验结果没有任何条带时，可优先考虑是否为模板降解的原因。

举例：细菌DNA的提取方法

1. 取1-2ml的菌液，12000rpm离心10min，去除上清，得到沉淀
2. 根据得到沉淀量，加入500ul左右的TE（配方如下）悬浮沉淀，并加入20ul的溶菌酶，37度保温30min
3. 加入30ul 10%的SDS和1mg蛋白酶K，混匀后37度保温1h
4. 加入120ul 5mol/l氯化钠，充分混匀，65度放置10min
5. 等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）充分混匀，12000rpm离心5min，得上清于干净的EP管中
6. 等体积的氯仿：异戊醇（24:1）充分混匀，12000rpm离心5min，得到上清于赶紧EP管中
7. 加入等体积的异戊醇，充分混匀，-20℃放置30min后10000rpm离心5min
8. 去除上清，得到DNA沉淀用70%的乙醇漂洗（动作轻柔，不要将沉淀冲起），吸干，通常可获得3-5ug的DNA

其他

1. Taq DNA聚合酶：Taq酶种类有很多，热启动酶，高保真酶，根据各自实验的应用选择合适的酶扩增，一般的反应，化学修饰的热启动酶即能很好的完成，化学修饰热启动酶能够避免低温下任何非特异性产物产生。酶的浓度对扩增有一定影响，酶用量过多，会导致非特异性产物，操作按照说明书即可。
2. dNTP：四种dNTP的浓度要相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会引发碱基的错误渗入。此外，dNTP能够和体系中镁离子结合，从而影响体系中镁离子的浓度。
3. 缓冲液：缓冲液一般随酶提供，一般的PCR试剂盒包括Taq酶，缓冲液，dNTP，水。初次扩增，可以完全按照试剂盒的说明书操作，如果扩增结果有问题，可自己尝试摸索实验条件或重新设计引物提取模板扩增。
4. 因空气中和手上有一定污染源，操作过程中要戴手套，在干净的环境中配置反应体系，防止空气中的污染源。
5. PCR扩增的水要经过高压灭菌或0.2um滤膜过滤。
6. 产物切胶回收二次扩增前，要先鉴定，二次扩增模板稀释1000倍。

四．常用试剂配方

电泳缓冲液

1. 50xTAE（pH8.5）

准确称取Tris 242g，EDTA（Na）37.2g于1L烧杯中，加入800ml去离子水，搅拌溶解，接入57.1ml乙酸，充分搅拌，调pH值8.5后定容至1L，室温保存。每次使用时稀释即可。

1. 10xTBE（pH8.3）

准确称取Tris 108g，EDTA 7.44g 硼酸55g于1L的烧杯中，加800ml去离子水，充分搅拌溶解，调pH8.3后定容至1L，室温保存。每次使用前稀释即可。

上样缓冲液

6xLoding buffer

0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝，30%甘油溶于双蒸水中，4℃保存。

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