通常胶在30分钟到1小时内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,AP剂量不够。 如果凝的太快,可能是AP和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。
前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的,一般对电泳结果不会有太大的影响。
根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
在较厚的凝胶中,由于凝胶不均匀冷却,中间部分凝固不好。
电泳系统温度偏高。
处理办法:待其充分凝固再作后续实验。
一般原因是两板之间的底部间隙气泡未排除干净,或聚合不完全。
处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。
原因:电极不平衡或者加样位置偏斜。
原因:加样量过多。
电泳中条带很粗是常见的事,主要是浓缩胶的原因。
处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确;适当降低电压。
“鬼带”就是在跑构象复杂的蛋白质大分子时,在泳道顶端出现一些未知条带或在加样孔底部生成沉淀,这主要是因为还原剂在加热的过程中被氧化失活,使解离的蛋白质分子重新折叠和亚基重新缔合,由于其分子量通常要比目标条带大,所以会生成未知条带或沉淀。
处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。
我们在实验中有时会出现溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。
主要原因:缓冲液和分离胶的浓度过高。
处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。
SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸,电泳开始后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
现象:电压50v以上,可电流却在5mA以下。
主要原因:电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:内外槽装反;外槽液过少等。
处理办法:正确装配电泳槽即可。
使聚丙烯酰胺的充分聚合,可以提高凝胶的分辨率。
建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。
可能是因为凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。
缓冲液在电泳过程中的主要作用是维持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应,正极发生的是氧化反应,负极发生的是还原反应,长时间的电泳将使正极变酸,负极变碱。缓冲液可以维持溶液两极的pH保持基本不变。在浓缩胶中,pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动并聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。
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