十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。此项技术的原理,是根据检体中蛋白质分子量大小的不同,使其在电泳胶中分离。在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中,SDS-PAGE更是必不可少的操作,其通常用于检测蛋白的表达情况(表达量,表达分布),以及分析目的蛋白的纯度等。
蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-),不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷,为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关,我们在上样前,通常会进行一些处理(上样
缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠
(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),是一种阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构; β-巯基乙醇是强还原剂,它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后,经过高温处理,其目的是将SDS 与蛋白质充分结合,以使蛋白质完全变性和解聚,并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷;另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料,用于监控整个电泳过程;另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极,下方为正极),在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶,使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
电泳启动时,蛋白样品处于pH6.8 的上层,pH8.8 的分离胶层在下层,上槽为负极,下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续:启动时Cl¯解离度大,Pro¯解离度居中,甘 aaCOO¯解离度小,迁移顺序为(pH6.8)Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯与 Pro¯之间和 Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区,同时也出现高电势,高电势迫使 Pro¯向 Cl¯迁移,—COO¯向 Pro¯迁移。如:一个 Cl¯领路,—COO¯推动,蛋白在中间,这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中,由于胶联度小,孔径大,Pro¯受阻小,因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层,起浓缩效应,使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时,此时Pro¯,Cl¯,甘 aa 离子在 pH8.8 的溶液中,Cl¯完全电离而很快到达正极,甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质,而到达正极,只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于 Pro¯在电泳过程中,受到溶液离子的变化而 pH 值发生变化,但每一瞬间,其所带电荷数除以单位质量是不同的,所以带负电荷多者迁移快,反之则慢,这就现了电荷效应。由于胶孔径小,而且成为一个整体的筛状结构,它们对大分子阻力大,小分子阻力小,起着分子筛效应,也就是蛋白质在分离胶中,以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异,最终达到彼此分开。
PAGE 胶的聚合原理:甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合,形成胶,如下图:
注:催化剂:过硫酸铵(AP)在隔氧的状态下,最好现配现用,使用新鲜的。
加速催化剂:TEMED,四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围:
丙烯酰胺浓度(%) | 线性分离范围(KD) |
---|---|
15 | 10~ 43 |
12 | 12~ 60 |
10 | 20~ 80 |
7.5 | 36~ 94 |
5.0 | 57~212 |
通常在SDS-PAGE电泳实验中用到以下几种试剂:
1、主要试剂
2、实验器材
SDS-PAGE所需溶液:
A液——30%丙稀酰胺(W/V):丙稀酰胺29.2g,N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g,加入去离子水定容至100mL,pH值不能超过7.0,过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
B液——1.5mol/L Tris·HCl,pH8.8:18.17g(9.09g)Tirs碱,溶于60mL(30mL)去离子水中,加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8,定容至100mL(50mL)。
C液——1.5mol/L Tris·HCl,pH6.8:12.1g(6.05g)Tirs碱,溶于60mL(30mL)去离子水中,加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8,定容至100mL(50mL)。
D液——10%SDS:10g (2g)SDS溶于去离子水中,定容至100mL(20mL),加热至68℃助溶。
E液——10%过硫酸铵:5g(0.5g)过硫酸铵,溶于50mL(5mL)去离子水中;现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺)原液,低温保存。
聚丙烯酰胺(Acrylamide)的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关。
制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择TRIS-HCL系统。
TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行。
十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
注意:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收,其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺(N,N’-Methylenebisacrylamide)时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能会含有少量未聚合材料。
1. 清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉 轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样
分离胶和浓缩胶的制备:按下表中溶液的顺序及比例,配置12%的分离胶和5.1%的浓缩胶。
试剂名称 | 12%的分离胶(8块,35ml) | 5.1%的浓缩胶(8块,12ml) |
---|---|---|
30%凝胶贮备液/ml | 14 | 2 |
分离胶缓液
(pH8.8)/ml |
8.75 | |
浓缩胶缓冲液(pH6.8)/ml | 3 | |
双蒸水/ml | 12.25 | 6.9 |
10%过硫酸铵/ul | 175 | 100 |
TEMED/ul | 15 | 10 |
注:分离胶与浓缩胶的浓度计算公式:
A%*Va/V总 =C ,A%为30%凝胶贮备液,
例如,12%的分离胶:0.3*10/25=12%
3. 电泳
加样完毕,盖好上盖,连接电泳仪,打开电泳仪开关后,样品进胶前电压控制在100~200V,大约15~20min;样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后,电压升到200V,电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1~2cm处即停止电泳,约0.5-1小时。如室温高,打开电泳槽循环水,降低电泳温度。
电泳。
4. 染色、脱色
电泳结束后,关掉电源,取出玻璃板,在长短两块玻璃板下角空隙内,用刀轻 轻撬动,即将胶面与一块玻璃板分开,然后轻轻将胶片托起,指示剂区带中心插入铜丝作为标志,放入大培养皿中染色,使用0.25%的考马斯亮蓝染液,染色2~4h,必要时可过夜。
弃去染色液,用蒸馏水把胶面漂洗几次,然后加入脱色液,进行扩散脱色,经常换脱色液,直至蛋白质带清晰为止。
5. 结果处理
相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)
SDS-PAGE电泳实例图
注意:温度,时间,光照,APS和TEMED都会对凝胶产生影响
查看SDS-PAGE实验FAQ:SDS-PAGE常见问题(FAQ)
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