本文主要介绍了大肠杆菌蛋白表达原理、具体操作步骤、大肠杆菌表达系统及其与其他系统的比较等。
诱导原理:Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白,都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态,Lac阻遏物能与操纵基因O结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后,其蛋白构象就发生变化,导致阻遏物从操纵基因O上解离下来,RNA聚合酶不再受阻碍,发生转录。详情见IPTG诱导蛋白表达的原理
不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。基因构建参考密码子优化,蛋白纯化参考蛋白纯化专题。以下内容主要包括蛋白表达鉴定:
1. 表达鉴定第一天的任务,常用抗性选择根据感受态细胞选择
2. 表达鉴定第二天的任务,注意Pcold的表达温度
3. 表达鉴定第三天,全菌的表达鉴定分析,注意控制溶质的量及溶液黏度
大肠杆菌表达现象 | 可能原因 | 建议宿主菌 |
---|---|---|
无蛋白表达或出现截短蛋白 | 密码子偏移性 | Rosetta 2 Rosetta gami 2 Rosetta gami B RosettaBlue |
细胞死亡,生长极困难 | 基因产物为毒性蛋白 | pLysS 菌株 |
蛋白无活性 | 蛋白错误折叠 | Origami 2 Rosetta gami 2 Rosetta gami B |
无克隆生长 | 过高本底表达 | pLysS、pLysE 菌株 |
以T7启动子、T7RNA聚合酶等T7噬箘体转录体系的元件为核心构建的表达系统。T7 RNA聚合酶一种高活性的RNA聚合酶,mRNA的合成速度比大肠杆菌内的RNA聚合酶快5倍,并某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶转录的序列也可以转录,所以T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的存在的情况下,大肠杆菌本身的转录竞争不过T7噬箘体转录体系,最终受T7噬箘体启动子控制基因的转录。
它是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的大肠杆菌表达系统,具有多顺反子结构,结构排列为:
启动子(lacP)- 操纵基因(lacO) – 结构基因(lacZ-lacY-lacA)
原理:在无诱导物的情况下,负调节因子lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白与启动子下游的操纵基因紧密结合,阻止转录的起始。加入诱导剂后,IPTG与lacI基因产物结合,使操纵基因解离出来,lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。
以启动子PL、PR为核心构建的表达系统。PL和PR表达系统具有很强的启动转录能力,诱导时不需要加入化学诱导剂,成本低廉,但在热刺激过程中,大肠杆菌中的一些蛋白水解酶会被激活,降解所表达的外源蛋白;其次是在大规模发酵培养菌体时,通过热平衡交换方式提高温度,需要较长的时间,这会降低诱导效果,从而对重组蛋白的表达量有影响。
此外还有其他表达系统,如pH调控型、营养调控型、糖原调控型等。
大肠杆菌表达系统比较
种类 | 优点 | 缺点 |
---|---|---|
T7大肠杆菌表达系统 | 目的基因的表达水平高 | 较高的本底表达 |
Lac表达系统 | 易于调控和操作 | 对表达和制备用于医疗的重组蛋白不适合 |
Tac表达系统 | 易于调控,转录水平高于lac | 对表达和制备用于医疗的重组蛋白不适合 |
PL和PR表达系统 | 不需要加入化学诱导剂,成本又低廉,转录能力强 | 可能降解所表达的重组蛋白,不适合大规模培养 |
大肠杆菌与其他表达系统比较
表达系统 | 优点 | 缺点 |
---|---|---|
大肠杆菌表达系统 | 大肠杆菌表达系统具有表达背景清楚,表达水平高,操作简单,培养周期短,抗污染能力强 | 表达真核基因只能用其cDNA,不能进行翻译后的修饰加工,含有大量内毒素 |
哺乳动物表达系统 | 可以使蛋白正确折叠,提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等加工修饰,更接近于天然蛋白 | 产率低,某些糖基化产物不稳定、不易纯化,费用昂贵 |
酵母表达系统 | 使用简单,表达量高,可大规模生产,与原核相比可对异源蛋白修饰 | 酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 |
昆虫表达系统 | 高效表达,完善的加工修饰,易从无血清上清中纯化蛋白,无内毒素 | 外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下,由于病毒感染,细胞开始死亡,无法进行连续性表达 |
原核表达常见问题(主要包括蛋白不表达,蛋白表达不在上清,包涵体复性解决等相关问题)。
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