大肠杆菌蛋白表达SOP
本文主要讲述了大肠杆菌蛋白表达实验中感受态细胞制备实验流程和原理
感受态,是指宿主细胞最容易接受外源基因并实现将其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄以及外界环境因子的影响, 比如Ca2+就可以大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备感受态细胞最常用的方法是用预冷的CaCl2处理对数生长期的细菌,即用低渗CaCl2溶液在低温(0℃)时处理快速生长(进入对数生长期)的细菌,从而获得感受态细胞。此时细胞膨胀成球形,外源DNA分子在低温条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细胞表面,通过热激处理促进细胞对外源DNA分子的吸收。转化效率非常高。此方法的关键在于选用的细胞必须处于对数生长期,实验操作必须在低温无菌环境下进行。
1、实验仪器及试剂
LB培养基(固体、液体):Tryptone 1.00g,Yeast 0.50g,NaCl 1.00g,定容至100ml。(固体培养基加入1.5%的琼脂)
抗性:卡那霉素,氨卞青霉素,氯霉素,四环素。
2、 实验方法及操作步骤
随机取1支本次制备的感受态细胞,转化一个以前转化成功的质粒,从转化平板上的菌落数及表达鉴定的SDS-PAGE电泳图(看是否出现其他的杂带及蛋白表达情况)判断感受态的效价。如果效价好,这批感受可以用;否则,要重新制备。
1、每次取感受态细胞时,注意查看库存,保证库存不低于15支,少于15支时要及时制备。
1、菌株生长在对数时进行CaCl2处理。
2、全程操作要【低温无菌】。
3、用CaCl2溶液悬浮菌体时要均匀,不要有块状。
4、常用感受态细胞的选择抗性:BL21(DE3)无抗性;BL21 Codon plus(DE3)具有氯霉素抗性;OrigamiB(DE3)具有卡那霉素抗性,不能用于具有卡那霉素抗性质粒的表达;BL21(DE3)plysS具有氯霉素抗性;Rosetta(DE3)具有氯霉素抗性;Shuffle具有链霉素抗性或不用抗性。
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