双向凝胶电泳原理/实验步骤

双向凝胶电泳，广义上理解就是将某一样品进行电泳后，为了达到不同的分离目的在它的直角方向在进行一次电泳。常用的就是等电聚焦电泳（载体两性电解质pH梯度或固相载体pH电泳）之后在进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。样品经过电荷和质量两次分离之后，可以知道样品的分子量等电点等信息，分离的结果不是带而是点。

以等电聚焦–聚丙烯酰胺凝胶电泳为例的实验操作

双向凝胶电泳实验步骤

（一）水化上样

1. 从冰箱中取出IPG胶条，室温下下放置10min；
2. 沿着水化槽的边缘从左向又加入样品（槽两端各1cm不加样品），中间样品液一定要连贯，不要产生水泡，不然会影响胶条中蛋白质的分布；
3. 用镊子轻轻撕去IPG胶条的保护层（碱性端较脆弱，应该小心操作）；
4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品液上（不要将样品液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收，还会使胶条下面产生气泡，如果有气泡，来回移动胶条，直到赶走气泡）
5. 放置40min，直到大部分的样品被胶条吸收，慢慢加入矿物油，防止胶条水化过程中液体蒸发
6. 将等电聚焦仪放于-20℃，水化11-15小时。

（二）等电聚焦

1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加去离子水5-8ul；
2. 取出水化好的胶条，将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于润湿好的滤纸片上去除表面的不容物；
3. 将IPG胶条面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极精密接触；
4. 在每根胶条上滴2-3ml的矿物油；
5. 对好正负极，盖好盖子。设置等电聚焦程序；
6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡，第二向SDS-PAGE电泳或者是保存于-20℃，电泳前10min时取出。

（三）SDS-PAGE电泳

1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶；
2. 配制胶条平衡缓冲液；
3. 准备厚的滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上，将另一份厚滤纸用Millio水浸湿，汲取多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹；
4. 将胶条转移至样品水化盘中，加入6ml（17cm IPG）平衡缓冲液I，在水平摇床上摇晃15min；
5. 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ，第一次平衡技术后，滤纸上离去多余的液体，放在平衡缓冲液Ⅱ中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15min；
6. 用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将第二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己；
7. 琼脂糖液体加热溶解，在100ml量筒中加入TGS电泳缓冲液；
8. 第二次平衡结束，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液，用镊子夹住胶条一端，使胶面完全浸入在电泳缓冲液中漂洗几次；
9. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入琼脂糖封胶液；
10. 注意不要在胶条下产生气泡，将胶条和聚丙烯酰胺凝胶面完全接触；放置几分钟，待琼脂糖凝固；
11. 打开二向电泳制冷仪，调温度至15℃；
12. 将凝胶电泳转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，一开始低电流，待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，加大电流，溴酚蓝指示剂到达底部边缘时停止电泳；进行染色观察。